HPLC ou CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência • Matrix LCMS

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, CLAE ou em inglês: HPLC – High Performance Liquid Chromatography – é uma técnica de separação moderna e muito empregada em indústrias farmacêuticas, químicas, alimentícias, de cosméticos e petroquímicas, análises ambientais, além de emprego em amostras biológicas, nas áreas médicas, laboratórios de análises clínicas, ambiental e forense, e em muitos outros campos da ciência e da pesquisa. A capacidade de separar espécies em misturas complexas fez da HPLC uma técnica essencial para fins qualitativos e quantitativos. Para alcançar resultados precisos e fidedignos, os ensaios por HPLC devem ser realizados por profissionais altamente qualificados e treinados.

Nesse contexto, é muito importante o conhecimento profundo da técnica cromatográfica e dos detalhes dos componentes de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência.

HPLC e seus componentes

Exemplo de sistema de cromatografia líquida e alta eficiência – ACQUITY™ Arc™ System ( Waters™)

Os sistemas de cromatografia líquida são compostos (com pequenas variações) de:

Bomba Cromatográfica: módulo responsável por manter o fluxo constante em todo o equipamento e também por gerenciar mistura entre diferentes solventes.
Injetor Automático: gerenciador de amostras, responsável por coletar e transferir o volume de amostra desejado.
Forno de colunas: compartimento responsável por manter a temperatura constante na coluna cromatográfica.
Detector: módulo capaz de capitar o sinal do composto, sendo que a intensidade do sinal deve ser proporcional a concentração do analito de interesse. Os módulos mais conhecidos de detecção são: PDA, UV-Vis, IR, FLR, ELSD, Eletroquímico e MS.

Além dos módulos mais comuns citados acima, o sistema cromatográfico é acompanhando por um computador/software: Estação de trabalho, capaz de converter o sinal capitado pelo detector em um cromatograma, processar dados e exporta-los.

HPLC | UHPLC | UPLC™

Os sistemas cromatográficos apesar de apresentar a mesma função, a de separação de compostos de uma mistura, há diferenças entre os sistemas de cromatografia e inclusive entre os diferentes fabricantes. Sempre com o objetivo de obtenção de maior eficiência e melhor relação custo benefício, a determinação de um sistema de cromatografia líquida como sendo de alta eficiência ou ultra eficiência esta relacionada as colunas cromatográficas, os respectivos tamanhos de partícula, quanto o equipamento suporta de pressão e quanto a engenharia do módulos é capaz de minimizar a dispersão das moléculas. Atualmente a classificação dos sistemas de cromatografia líquida são:

HPLC – High Performance Liquid Cromatography

Colunas cromatográficas que variam de 2.7 µm a 5.0 µm.
Dispersão > 30µL e volume do sistema: 1100µL
Exemplo: Sistema HPLC ALLIANCE ( Waters™) | Coluna CORTECS™ 2.7 µm solid-core | Pressão: 6.000 psi.

2. UPLC™ – Ultra Performance Liquid Cromatography

Colunas cromatográficas que variam de 1.6 µm a 1.8 µm.
Dispersão < 12µL e volume do sistema: 360µL
Exemplo: ACQUITY UPLC I-Class PLUS System ( Waters™) | CORTECS™ 1.6 µm solid-core | Pressão: 18.000 psi.

O UPLC™ nasce com o propósito de ser mais eficiente que os HPLCs e para isso, desenvolveram colunas cromatográficas empacotadas com partículas de 1.6 – 1.8 µm, bem como a criação de equipamentos capazes de suportar pressões de 18.000 psi, esses dois dados levou a cromatografia líquida a outro patamar.

Historicamente a evolução da cromatografia foi baseada na diminuição de tamanho de particulas e aumento de capacidade de separação, resolução de separação entre diferentes compostos dentro de uma mesma mistura. A diferença chave entre HPLC e UPLC™ é que o HPLC permite a análise de partículas com tamanho em torno de 5 µm, enquanto UPLC™ permite partículas muito menores em torno de 2 µm. HPLC e UPLC™ são ambas técnicas cromatográficas líquidas que são úteis na separação dos componentes de um composto.

Mas e os sistemas chamados UHPLCs?

3. UHPLC – Ultra High Performance Liquid Cromatography

Sistemas que admitem colunas 2.x µm e que também podem ser usados com colunas 3.5µm e 5.0µm, Isso proporciona a flexibilidade para oferecer suporte a uma ampla gama de aplicações LC.
Exemplo: ACQUITY™ Arc™ System ( Waters™) e o Arc™ HPLC System ( Waters™) | XBridge™ C18 2.5 µm | Pressão: 9.500 psi.
Dispersão entre 12µL e 30µL, volume do sistema: 700µL

O UHPLC nasceu para suprir uma demanda intermediária entre o HPLC e O UPLC™, de maneira que mantenha a eficiência, precisão, exatidão e flexibilidade da transferência de metodologias analíticas entre HPLC e UPLC™. O UHPLC é capaz de admitir em um mesma engenharia colunas acima de 2µm, ou seja, um sistema que pode ser manipulado pelo próprio usuário para atingir sucesso na transferência entre metodologias de HPLC e UPLC™, além de apresentar mais uma alternativa para o desenvolvimento de métodos.

HPLC ou CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: A técnica de cromatografia líquida

Na cromatografia líquida necessariamente temos que ter a composição de duas fases, uma fase móvel e outra fase denominada de estacionária. Cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em íntimo contato.

Diferentes tipos de separação cromatográficas e os esquemas de separação.

Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. A fase sólida, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas é chamada de adsorção.

Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição.

Além destes dois tipos de separação mencionados, pode-se observar outros esquemas de separação. Segue ao lado uma figura exemplificando os mecanismos de separação na cromatografia.

Na fase móvel utiliza-se uma mistura de solventes, por exemplo, água ultrapura, acetonitrila e metanol, a mistura ou somente um solvente é o eluente. Algumas informações são pertinentes sobre a fase móvel:

Os solventes devem ter alto grau de pureza,
O eluente deve ter baixa viscosidade;
A amostra deve ser solúvel na fase móvel;
Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra.

Existem dois tipos de eluições:

Isocrática: a composição da fase móvel se apresenta constante durante todo o processo de análise. Normalmente se utiliza um tipo de solvente.
Gradiente: a composição da fase móvel pode ser alternada durante a realização da análise.

Os modos de eluição das fases móveis e a aplicabilidade dos sistemas cromatográficos é um assunto mais extenso e será abordados em nossos próximos posts. No momento é importante saber que o modo de eluição é determinado pela assertividade de separação dos compostos presente na mistura (amostra) e o tipo de eluição, se isocrático ou gradiente, é garantido pelos componentes da bomba cromatográfica.

A introdução do conceito de cromatografia líquida é importante para o entendimento de HPLC ou CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, bem como a história dessa técnica. Fizemos um breve ensaio sobre a história da cromatografia, como ela surgiu e sua evolução. Confira os três capítulos da história da cromatografia: PARTE 1 | PARTE 2 | PARTE 3.

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